NY/T 3073-2017 家畜魏氏梭菌病诊断技术[高清PDF]

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(*注：以下内容并未完全按照原文进行排版，且信息并不完全，也未经过严格校对，所以仅供参考！建议【不要直接作为从业依据】！具体信息还请阅读标准原文PDF。)

1范围

本标准规定了家畜魏氏梭菌病的诊断技术。

本标准适用于家畜魏氏梭菌病的临床诊断、实验室诊断、检验检疫、监测及流行病学调查等。

2临床诊断

2. 1牛魏氏梭菌病

2. 1.1牛魏氏梭菌病主要由D型、E型产气荚膜梭菌感染引起。

2. 1.2不同年龄、不同品种的牛（黄牛、奶牛、水牛等）均可感染发病，且四季均可发生。发病黄牛、犊牛 多为体格强壮、膘情较好者，奶牛多为高产牛。病程长短不一，短则数分钟至数小时，长则3 d〜4 d或更 长;有的呈跳跃式发生。

2. 1.3临床表现为突然不安、呼吸困难。最急性型病例无任何前驱症状，倒地死亡，有的在使役中或使 役后突然死亡。

2. 1.4急性型病牛体温升高或正常，呼吸急促，精神沉郁或狂躁不安,全身肌肉震颤、抽搐，行走不稳， 口流白沫，最后倒地而死。

2. 1.5亚急性型呈阵发性不安，发作时两耳竖直，两眼圆睁，表现出高度的精神紧张，后转为安静，如此 周期性反复发作，最终死亡。

2. 1.6急性和亚急性病牛有的发生腹泻，肛门排出含有多量黏液、色呈酱红色并带有血腥异臭的粪便， 有的排粪呈喷射状水样。

2. 1.7病理变化以全身实质器官出血和小肠出血为主要特征，肠道臓气。

2.2羊魏氏梭菌病

1羊魏氏梭菌病主要由D型、B型产气荚膜梭菌感染引起。

2. 2.2不同品种（小尾寒羊、黑山羊、奶山羊、绵羊、卡拉库尔羊等）、不同年龄的羊均可感染发病，一年 四季均可发生,但以春秋多发,尤其是天气骤变、气温突然下降时。

2.2.3 一般都是急性发作，病羊磨牙流涎,排带黏液粪便，有的为黏液性黑色混血稀粪。死后不久，腹 部迅速膨大，口鼻常有白色或带血泡沫流出。

2.2.4病理变化为整个肠道黏膜充血，特别是小肠充血、出血、黏膜脱落；胃黏膜脱落,有出血性炎症； 肾变软（肾糜烂），稍加触压即溃烂，水冲洗后，肾表面呈绒毛状。

2.3猪魏氏梭菌病

1猪魏氏梭菌病主要由A型、C型产气荚膜梭菌感染引起，称猪梭菌性肠炎、猪传染性坏死性肠 炎、仔猪红痢等。

2. 3. 2该病病程短,死亡快，死亡率高，一旦流行会导致大批仔猪死亡,但年龄稍大的猪造成死亡的 少见。

2.3.3主要临床症状为腹泻、粪便呈红褐色，粪便有腥臭味。

2.3.4病理变化为肠黏膜及黏膜下层广泛出血,肠壁呈深红色、部分肠段臓气。肠壁变得薄而透明，空 肠与回肠充满胶冻状液体。盲肠内有稀粪且有恶臭气体，胃黏膜脱落。

2. 4. 1

2. 4.2

奶幼兔发病率与死亡率较高。病兔在水泻的当天或次日即死亡，多为急性死亡。

2.4.3以急性腹泻，排黑色水样或带血胶冻样粪便。肛门周围、后肢及尾部被毛被稀粪污染。抓起病 兔摇晃躯体有泼水音。

2. 4. 4病理变化为胃底黏膜脱落，并有大小不等的黑色溃疡，肠黏膜呈弥漫性充血或出血，小肠充有气 体,肠壁变薄，盲肠和结肠内充满气体和黑绿色稀粪便，有腐败臭味，膀胱积有茶色尿液。

2.5结果判定

根据动物表现出的上述临

3. 1仪器、材料准备

3.1. 1仪器 光学显微镜

3.1.2培养基 胰豚一亚

3.2涂片、霍

采取清爆

氏染色反应.

3.3样品采.

无菌采集病 （适宜比例的 3.4细菌分离

接种环取3 观察菌落形态，将』 厌氧培养24 h分离 臭味,菌落颜色由灰

3.5产气荚膜梭菌纯培

挑取疑似菌落，涂片镜桢

3.6生化鉴定

对葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、果糖、乳糖、 盐试验、明胶液化进行试验。把分离株菌液加入生化反应发酵管中，厌氧培养24 h,观察生化试验结果。

3.7牛乳培养基进行暴烈发酵试验

该菌能使牛奶培养基“暴烈发酵” o

3.8结果判定

4产气荚膜梭菌毒素基因的PCR检测

4. 1材料准备

4. 1. 1仪器

厌氧培养箱、超净工作台、PCR仪、电泳仪、凝胶成像仪、数显恒温水浴锅、振荡器、离心机、高压灭 菌锅。

4. 1.2培养基和试剂

血琼脂平板、增菌培养基、Taq酶、DNA模板、dNTPs、双蒸水。

4.2引物

根据产气荚膜梭菌4种主要毒素基因序列和国内外公开发表的引物序列合成通用引物（见表1）。

表1引物序列

基因»bp

上游引物（5七3‘）

下游引物（5'-3‘）

a(alpha)cpa(325)

GCTAATGTTACTGCCGTTGA

CCTCTGATACATCGTGTAAG

B(beta)cpb(196)

GCGAATATGCTGAATCATCTA

GCAGGAACATTAGTATATCTTC

€ ( epsilon) etx( 656)

GCGGTGATATCCATCTATTC

CCACTTACTTGTCCTACTAAC

r(iota) iap(446)

ACTACTCTCAGACAAGACAG

CTTTCCTTCTATTACTATACG

DNA模板的制备

1增菌

将第3章分离鉴定的产气荚膜梭菌接种于营养肉汤培养基中,43°C厌氧培养12 h。

4.3.2模板制备

取增菌培养物于ImL离心管中,8 000g离心1.5 min〜2 min,弃去上清，加入100 ML TE（配制方 法见附录B中的B. 1）混匀作为模板。

PCR 反应体系（25 jiL）

1 PCR反应体系

lOXTaq buffer(含 M/+)

2. 5 ptL

dNTPs

2. 5 ptL

上游和下游引物（10 pmol/必）

各1/L

模板

2ML

无菌双蒸水

15. 75 ML

Taq DNA聚合酶

0. 25 ML

4.4.2对照

同时设立阳性对照、阴性对照和空白对照，用B型（NCTC 8533）,E型（NCTC 8084）产气荚膜梭菌

标准菌株的菌体做阳性对照，用大肠杆菌标准菌株的菌体做阴性对照，用无菌双蒸水做空白对照。

4. 5 PCR反应

94°C变性5 min,然后30个循环，分别为：94°C变性30 s；53°C退火30 s；72°C延伸1 min。最后72°C 延伸10min,4°C保存。

4.6电泳

用TAE（配制方法见B. 2）制备1%琼脂糖凝胶，加样6 ML~8在电压80 V-100 V、电流40 mA

下进行电泳30 min~40 min。

4.7结果判定

用凝胶成像仪观察扩增条带，在阴性对照和空白对照泳道无条带，阳性对照泳道出现a325 bp、（3196

3

（以上是摘录部分标准内容，更多信息还请参考原文PDF）

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