NY/T 3629—2020 马铃薯黑胫病菌和软腐病菌PCR检测方法[高清PDF]

标准简介

[NY/T 3629—2020]《马铃薯黑胫病菌和软腐病菌PCR检测方法》是gt中华人民共和国农业农村部发布的农业行业标准标准,适用于全国。

标准截图

马铃薯黑胫病菌和软腐病菌PCR检测方法
马铃薯黑胫病菌和软腐病菌PCR检测方法(截图)

 

标准文档说明

标准文档类型为马铃薯黑胫病菌和软腐病菌PCR检测方法高清PDF版本(文字版),标准文档内可进行搜索,可以复制原文,可粘贴。

标准部分原文

(*注:以下内容并未完全按照原文进行排版,且信息并不完全,也未经过严格校对,所以仅供参考!建议【不要直接作为从业依据】!具体信息还请阅读标准原文PDF。)

马铃薯黑胫病菌和软腐病菌PCR检测方法

1范围

4.7 1XTAE电泳缓冲液昌

量取50XTAE电泳缓冲液』

4.9漠化乙锭溶液(10 mg/mL)或GelRed核酸凝胶染料(漠化乙锭替代物) 称取漠化乙锭200 mg,加水溶解,定容至20 mLo

GclRcd核酸凝胶染料按照商品推荐稀释浓度使用。

10 1.0%琼脂糖凝胶板

称取琼脂糖1. 0 g,加入1XTAE电泳缓冲液定容至100 mL,微波炉中加热至琼脂糖融化,待溶液冷 却至50°C~60°C时,加漠化乙锭溶液或GelRed核酸凝胶染料5卩L,摇匀,倒入制胶板中均匀铺板,凝固后 取下梳子,备用。

11引物缓冲液

用水将上、下游引物分别配制成工作浓度为10 ng/ML的溶液。

12 2 000 bp DNA分子量标准物。

13 6X电泳上样缓冲液。

5主要仪器

1 PCR 仪。

2台式高速离心机(离心力1 180 g〜12 470 g)。

5.3电泳仪、水平电泳槽。

5.4凝胶成像仪。

5 移液器(0. 1 渉〜2. 5 乂L、0. 5 渉〜10 MLJ0 ML~100 卩1八20 卩L〜200 >L、100 卩L〜1 000 产L)。 5.6灭菌锅等。

6操作步骤

6.1对照的设立

试验分别设立阳性对照、阴性对照和空白对照(即用等体积的水代替模板DNA作空白对照),在检测 过程中要同待测样品一同进行如下操作。

6.2样品制备

取马铃薯试管苗、茎、块茎维管束组织或发病组织0. 1 g,现用现取或4°C条件下保存(少于7d)o

6.3 DNA提取

3. 1植物组织样品DNA提取

将样品置于研钵中,加液氮研磨成粉末,转至1.5 mL离心管。后续操作参见植物基因组DNA提取 试剂盒推荐步骤进行。

3.2菌株样品DNA提取

菌株水溶液经4 000 r/min离心后,弃掉上清液,留沉淀。后续操作参见植物基因组DNA提取试剂 盒推荐步骤进行。

4 PCR扩増

6. 4. 1 PCR扩增引物

上、下游引物为Pa、Rc、Dch的特异性引物,见附录A。

6.4.2 PCR反应体系

按表1顺序加入相应试剂(缩略语见附录10 .混匀,离心10 s,使液体都沉降到PCR管底。

表1 PCR扩増反应体系

试剂名称

每个反应中加入量,卩L

16. 3

10XPCR缓冲液(含Mg2*)

2.5

dNTP混合物

4.0

上游引物(10卩mol)

0. 5

下游引物(10呻。1)

0.5

Taq DNA聚合酶(5 U/渉)

0. 2

样品量(DNA)

1.0

总体积

25.0

6.4.3 PCR反应程序

引物名称

第一步

第二步

第三步

ECAlf

94 C , 5 min

循环 36 次:94°C, 30 s;62°C, 45 s;72°C, 45 s

72°C, 7 min

ECA2r

EXPCCF

94°C, 5 min

循环 30 次:94°C , 60 s; 60°C , 1 min; 72°C , 2 min

72°C, 7 min

EXPCCR

ADE1

94 C , 5 min

循环 25 次:94°C, 60 s; 72°C, 2 min

72°C, 7 min

ADE2

7琼脂糖凝胶电泳

使用1. 0%的琼脂糖凝胶板,按比例混匀电泳上样缓冲液和PCR扩增产物,用DNA分子量标准物作 为分子量标记,进行凝胶电泳。电泳结束后在凝胶成像仪的紫外透射光下观察,凝胶上是否出现预期的特 异性DNA条带,并拍摄记录。

8结果

8. 1试验成立的条件

阳性对照检测到预期大小的特异性扩增条带,阴性对照和空白对照均没有检测到预期大小的冃的条 带。若阴性对照、阳性对照和空白对照同时成立时,则表明试验有效,否则试验无效。

8.2阳性判定

待检样品若在690 bp对应位置出现特异性条带,则判定样品为Pa阳性;待检样品若在550 bp对应 位置岀现特异性条带,则判定样品为Pec阳性;待检样品若在420 bp对应位置出现特异性条带,则判定 样品为Dch阳性。

8.3阴性判定

待检样品若在690 bp对应位置未出现特异性条带,则判定样品为Pa阴性;待检样品若在550 bp对 应位置未出现特异性条带,则判定样品为Pec阴性;待检样品若在420 bp对应位置未岀现特异性条带, 则判定样品为Dch阴性。

(以上是摘录部分标准内容,更多信息还请参考原文PDF)

网盘链接

百度网盘:https://pan.baidu.com/s/1CPjCUbCBv5Po1JvZffFwSg
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