NY/T 3677-2020 家蚕微抱子虫荧光定量PCR检测方法[高清PDF]

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(*注：以下内容并未完全按照原文进行排版，且信息并不完全，也未经过严格校对，所以仅供参考！建议【不要直接作为从业依据】！具体信息还请阅读标准原文PDF。)

家蚕微抱子虫荧光定量PCR检测方法

1范围

本标准规定了家蚕微如子虫(Nosema bom bye is)的实时荧光定徳PCR检测方法。

本标准适用于家蚕蚕卵及家蚕幼虫组织中微抱子虫的检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的网I优必仲所勺。1、1|牛且I戸荫殉文件.収日期的版本适用于本文件。 凡是不注11期的引用文竹#'我肩葩孩))歸枯Q娅®好

(；IVT 6682 分菱噸包迦 3术语和定义

下列术语和

LUS rRNA

家張微抱』

缝丿丿J的很

FTA卡滤膜片 弗林徳斯遍

根据家蚕微抱 号伴随目的PCR产物^ 是否含冇家蚕微抱子金

5试剂与材料

除另有规定外，所用生化试衲为分嶼.实验用水应彳主卅「6极中一级水的规定。

1 Tris-HCK 1 mol/L,pH 8. 0)：痂爵.10 g Tris碱罕压杯終策人90 mL超纯水溶解，加入适址浓

HCI调pH至8. 0,定容至100 mL,高压灭菌，室温保存。

2 EDTA (0. 5 mol/L,pH 8. 0)：称取 18. 61 g EDTA 溶 f 90 mL 超纯水中，加入适量 NaOH 调节 pH 至8.(),定容至100 mL,高温灭菌后保存。

5. 3 TE缓冲液:分别量取5. 1溶液5. 0 mL、5. 2溶液1. 0 mL于烧杯中，加入400 mL超纯水均匀混合 后,定容至500 mL,高压灭菌，室温保存。

5.4 TE 1缓冲液:分别if取5. 1溶液5.0 mL、5. 2溶液0. 1 ml,「烧杯中，加入400 mL超纯水均匀混 合后,定容至500 mL,高压灭菌,室温保存。

5.5 30%K()H溶液:称取30. OOgKOH至烧杯中，缓慢加入超纯水搅拌溶解后,定容至100 mL,高压 灭閑，室温保存。

FTA纯化试剂。

5.9荧光定量P('R试剂盒。

10灭菌的枪头、离心管及牙签。

6主要仪器设备

1实时荧光定量PCR仪。

6.2紫外分光光度计。

3小型珠磨式蛆织研磨器。

6.4破碎管。

6.5微量加样器。

6.6微型打孔器。

6.7 -20°C 及一8O°C 冰箱。

7样品检测

1样品微抱子虫基因组DNA提取

1. 1将待检蚕卵样品充分混匀，随机选取200粒蚕卵用30%K()H溶液在37°C中浸没10 min, 一级水 冲洗2次,1 mol/L HC1中和1次，一级水冲洗2次，用灭菌牙签将蚕卵充分捣碎。称取待检蚕体组织约 200 mg,在冰上快速用灭菌剪刀将其珅碎。

7- 1-2将7. 1. I处理过的蚕卵样品或蚕体组织样品置于2 mL破碎管中，加入1/2管体积的玻璃珠及

1 ml, TE缓冲液，使用小型珠磨式组织研磨器,4 800 室温振荡破碎I min,将样品置于冰I：,待其冷却 后再重复振荡破碎5次。

7. 1. 3吸取100破碎液滴加到FTA卡滤膜片上，室温干燥。

7- 1.4从FTA卡滤膜片上打孔裁取1个直径约2 mm的小圆片，丿TJ FTA纯化试剂洗涤3次，然后用 TE 1缓冲液洗涤2次,56°C干燥后一20°C冷冻保存备川，作为荧光定量的模板。

7.2实时荧光定量PCE检测

7.2. 1引物序列

正向引物：5'-GGATCAATAGGATGTCATAACG3‘；

反向引物：5TGTTCATTCGCCACTACTAA-3ZO

荧光定量P('R产物相关信息参见附录A。

7. 2.2对照设置

阳性对照:含冇经7. 2. 1引物扩增的ISU rRNA基因片段的重组质粒DNA.拷贝数为1.0X101个/“L。 阳性质粒的制备参见附录B。

阴性对照:健康家蚕幼虫基因组DNA,浓度为50 ng/MLo

空白对照:灭櫥超纯水。

7. 2.3 PCR反应体系

实时荧光定员PCR反应体系见表lo

表1实时荧光定量PCR反应体系

试剂

体积/单个反应

2XSYBR Premix Exl'aq™

12. 5 “L

正向引物(10 ,miol/L)

0. 5 “L

反向引物(1()Mm<)l/L)

0. 5 /1L

表1 （续）

试剂

体积/单个反应

DNA模板

1个FTA |；滤膜片

■级水

补足至25 “L

总体积

25

注：I）NA模板若为阳性质粒与阴性对照,单个反应的体积均为1小。

反应程序：95°C预变性2 min.95°C 5 s,6O°C 31 s,共40个循环。每个样品垂复3次。可按照貝:他市 售商品化试剂盒说明书进行荧光定量PCR反应。

7. 2.4 PCR反应质量控制

扩增反应结束后，阳性对照出现典型的扩增曲线,空白对照和阴性对照的荧光曲线平直或低于阳性对 照荧光值的15%,表明反应体系工作正常。否则，表明PCR反应体系不正常，应重新检测。

8结果判定

在PCR反应体系正常工作的前提下.根据收集的荧光曲线和Ct值判定结果。判定规则如下：

a）待测样品检测（7值小于或等于阳性对照的Ct值，判定该样品检出家衣微抱子虫；

1））待测样品检测Ct值大于或等于阴性对照的Ct值，判定该样品未检出家蚕微抱子虫；

c）待测样品检测Ct值大于阳性对照的Cl值旦小于阴性对照的Ct值•，应重新做荧光定批PCR扩 增，若重复实验结果出现典型的扩增曲线,a值仍然在此范围，判定该样品疑似含有家蚕微抱 子虫。

（以上是摘录部分标准内容，更多信息还请参考原文PDF）

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